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Atingindo uma contagem de partículas e análise de tamanho confiáveis em  injeções, soluções oftálmicas e emulsões lipídicas.

A United States Pharmacopeia (USP) e outras agências como EP, JP e ChP estabeleceram métodos de teste para assegurar a minimização da contagem de partículas em injeções intravenosas (drogas parenterais) e soluções oftálmicas. A matéria particulada é tanto uma contaminação indesejada quanto um risco potencial para a saúde do paciente. Os testes são realizados tanto para a matéria visível, quanto para o material particulado subvisível. Os testes de material particulado subvisível incluem USP <787>, 1 <788>, 2 <789>, 3 <729>. 4

USP SUMARIOS DE PROCEDIMENTOS DE TESTE

USP <788>, Material particulado em injeções

As diretrizes USP estão em vigor para injeções de pequeno volume (SVI, volume <100 mL) quando as monografias especificam a necessidade e para injeções de grande volume (LVI, volume >100 mL) para infusões de dose única, a menos que uma exceção seja observada no mono gráfico individual. As drogas rotuladas como devendo ser usado um filtro final com o produto estão isentas, desde que os dados científicos apoiem a isenção. Outras isenções incluem preparações radio farmacêuticas e parenterais usados exclusivamente para soluções de irrigação.

Dois procedimentos são especificados:

. Método 1: Teste de contagem de partículas de obscurecimento leve;

. Método 2: Teste de contagem de partículas microscópicas.

O método 1 é o teste preferido e predominantemente utilizado. O método 2 é usado quando uma amostra falha (ou se aproxima da falha) o teste do método 1 ou quando o material da amostra (tais como emulsões) pode levar a contagens mais altas. O método 1 é abordado ao longo deste blog.

Os procedimentos básicos de teste e especificações para contagem de partículas de 10 a 25 µm são mostrados nas tabelas 1 e 2, tanto para injeções de pequenos como de grandes volumes. O relatório de teste SVI resulta em partículas/recipiente enquanto o relatório de teste LVI resulta em partículas/mL.

Tabela 1: Teste SVI e especificações.

Abrir/combinar 10 ou mais unidades em um recipiente limpo para volume NLT 25 mL

Degas (deixar de pé, banho ultrassônico ou vácuo)

Amostra 4 vezes, desconsiderar a primeira, média das três últimas

Contagem ≥10 e 25 µm

Critérios de aprovação/reprovação: 6000/recipiente ≥10 µm 600/recipiente ≥25 µm

 

Tabela 2: Teste LVI e especificações.

Menos de 10 unidades aceitáveis com plano de amostragem apropriado

Testar unidades individuais

Amostra 4 vezes, desconsideração primeiro, média das três últimas

Contagem ≥10 e 25 µm

Critérios de aprovação/reprovação: 25/mL ≥10 µm 3/mL ≥25 µm

 

O sistema AccuSizer^® SIS (Figura 1) é o instrumento ideal para realizar testes USP <788>.

As análises e relatórios são totalmente automatizados no software AccuSizer. Os protocolos definem volume de amostras (tipicamente 5 mL), número de análises (tipicamente 4), número de recipientes agrupados e volume/recipiente. O software calcula então os valores médios das execuções 2 – 4 e relata os resultados incluindo a determinação de aprovação/reprovação, como mostrado na figura abaixo.

USP <787>, Subvisible Particulate Matter in Therapeutic Protein Injections                                                                                    (Matéria Subvisível de Partículas em Injeções de Proteínas Terapêuticas)

USP <787> é uma alternativa para a USP <788>, fazendo alterações para volumes menores de produtos de teste, alíquotas de teste menores, e instruções adicionais de manuseio de amostras. Um resumo de como testar uma amostra seguindo o novo procedimento USP <787> e os critérios de aprovação/reprovação é mostrado na tabela 3.

Tabela 3: USP <787> teste e especificações.

A diluição pode ser necessária e é permitida, mas tem dados de apoio para a fundamentação e adequação do esquema selecionado

Preparo de amostra

Se houver unidades individuais de teste de volume suficientes

Se o volume for muito pequeno, misture as unidades e combine o conteúdo para obter o volume necessário (normalmente 0,2 – 5,0 mL)

Desgaseificar a amostra e misturar suavemente novamente

Critérios de aprovação/reprovação: SVI                                                            LVI 6000/recipiente ≥10 µm                            25/mL ≥10 µm 600/recipiente ≥25 µm                              3/mL ≥25 µm

 

As amostras de programação, execução e relatórios são todos automatizados pelo software AccuSizer, conforme descrito na descrição acima da USP <788>.

 

USP <789>, material particulado em soluções oftálmicas

Este teste é diferente dos três anteriores porque as partículas que são medidas são o produto da droga (uma emulsão), não a contaminação. As características de tamanho crítico das emulsões lipídicas injetáveis incluem o tamanho médio das gotas e a cauda de grande diâmetro >5 µm. Nenhuma técnica ou teste pode medir adequadamente ambos os parâmetros, portanto, existem dois métodos na USP <729>.

Método I – Método de dispersão de luz

Tanto a dispersão dinâmica da luz (DLS) como a difração a laser (referida como dispersão clássica da luz no método) é usada para medir o tamanho médio. Os procedimentos básicos de teste e as especificações para o tamanho médio das gotas são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5: USP <729> método I teste e especificações.

Verificar o desempenho do sistema com padrões de 100, 250, e 400 nm

Diluir a amostra até uma concentração apropriada

Meça o tamanho com o detector em um ângulo de 90°

Verificar se o valor da Chi Square é aceitavelmente baixo

Informe o diâmetro médio de intensidade

Critérios de aprovação/reprovação: Média < 500 nm (0,5 µm)

 

O sistema Nicomp^® DLS (figura 3) é o sistema ideal a ser utilizado nos testes do método I para determinar o tamanho médio das gotas. O cálculo do Chi Square é automatizado em cada medição e o algoritmo de análise multimodal Nicomp^® está disponível para amostras com picos múltiplos. A opção única de diluição automática, automatiza a medição de emulsões de alta concentração.

Método II – Método de obscurecimento leve

As caudas de gotas de grande diâmetro (PFAT5) são medidos usando um contador de partículas líquidas de obscurecimento/extinção leve que emprega a técnica de dimensionamento óptico de partículas simples (SPOS). Os procedimentos básicos de teste e as especificações para o tamanho médio das gotas são mostrados na tabela 6.

Tabela 6: USP <729> teste e especificações do método II.

Verificar o desempenho do sistema usando dois padrões de tamanho diferentes de ~5 e 10 µm

Diluir a amostra

Fixar o limite inferior de tamanho de 1,8 µm e o limite superior em 50 µm

Faça duas medições variando a concentração ou o tempo de medição para que haja pelo menos um fator de duas diferenças no número total de partículas >5 µm entre as duas séries

Critérios de aprovação/reprovação: O resultado ponderado por volume >5 µm (PFAT5) deve ser < 0,05%

 

O instrumento ideal para fazer medições do método II é o sistema AccuSizer APS (figura 4). O sistema AccuSizer APS fornece diluição automática, medições e resultados USP <729> método II, cálculos e relatórios (figura 5).

 

Orientação de Instrumentos em USP <1788>

A USP <1788>, 5 métodos para a determinação de material particulado em injeções e soluções oftálmicas fornece importantes informações de padronização e calibração, recomendações para o manuseio de amostras, ambiente de laboratório e treinamento de operadores. Estas diretrizes podem ser aplicadas a todos os testes de obscurecimento da luz para partículas subvisíveis em injeções.

Aparelho de teste

O instrumento utilizado deve ser “O aparelho é um sistema de contagem de partículas transportadas por líquido que utiliza um sensor de fotopolimerização com uma amostra adequada”. O instrumento AccuSizer utiliza um sensor de obscurecimento leve, mas vale a pena notar que o sensor LE400 é mais avançado do que o exigido por este capítulo da USP. A figura 6 mostra um diagrama do sensor LE400 e da eletrônica associada utilizada para realizar a medição.

O detector de extinção em alinhamento direto com o raio laser incidente realiza o componente de obscurecimento da luz da medição. O detector de dispersão adicional na posição de duas horas é usado para estender a faixa dinâmica até 0,5 µm, coletando também a luz dispersa da interação laser/partícula. O instrumento AccuSizer pode ser operado em modo de extinção (obscurecimento) usando apenas o detector de extinção ou modo de soma usando ambos os detectores. Nos tamanhos de 10 e 25 µm usados nestes testes USP, todas as medidas são feitas de obscurecimento da luz, uma vez que o sinal de dispersão é insignificante nestes tamanhos.

O sensor LE400 tem a maior sensibilidade específica (0,5 µm) de qualquer sistema usado para testes de partículas subvisíveis USP. Embora os critérios de aprovação/reprovação sejam estabelecidos em 10 e 25 µm, há benefícios significativos em ser capaz de detectar até a faixa de submícron. Se as contagens estiverem sempre próximas de zero a 10 µm, ter dados em faixas de tamanho menores pode proporcionar a capacidade de diferenciar os lotes que contêm mais ou menos partículas totais. Mais ou menos partículas em tamanhos menores no momento da fabricação podem indicar quais lotes podem manter contagens baixas ao longo da vida útil do produto. Dados adicionais de até 0,5 µm também é valioso tanto para a formulação quanto para o USP <787> teste de injeções de proteínas, fornecendo uma visão da agregação de proteínas. Os documentos de orientação USP para injeções de proteína sugerem a coleta de dados em faixas de tamanho menores, incluindo até 0,2 µm, possível quando se usa o sensor FX Nano.

 

Limites de concentração de sensores e faixa dinâmica

Todas as medições devem ser realizadas abaixo do limite de concentração do sensor para evitar erros de coincidência (duas partículas ao mesmo tempo estando presentes na zona de detecção). O limite de concentração do sensor LE400 é de 9.000 – 10.000 partículas/mL dependendo da altura do feixe do laser. Mas esta faixa não é importante quando os resultados dos testes a 10 µm devem estar sempre abaixo de cerca de 50 partículas/mL. Ao trabalhar com concentrações mais altas para testes USP <729> (ou injeções de proteína de alta concentração) o sistema AccuSizer APS pode diluir com precisão e automaticamente até 1 milhão para uma razão de diluição, e fornecer resultados calculados na concentração real de partículas da amostra/mL.

Testes de padronização de instrumentos

Precisão de volume e taxa de fluxo da amostra

Estes dois testes são facilmente realizados com o uso de balança e um cronômetro.

Calibração

O procedimento requer que o sensor seja calibrado em um mínimo de três tamanhos, muitas vezes com 10, 15 e 25 µm. Os métodos de calibração automática e eletrônica descritos na USP <1788> são antiquados em comparação com as capacidades do software AccuSizer. O sistema AccuSizer possui rotinas avançadas de calibração que garantem calibração otimizada, resolução e teste padrão de contagem. Todos os sensores LE400 são calibrados usando pelo menos doze tamanhos/pontos de curva (e não apenas três) na fábrica, antes da entrega. O mesmo procedimento de calibração detalhado é realizado em campo durante a visita de verificação bianual. O software AccuSizer rastreia automaticamente qual curva de calibração foi usada para cada e quando a última calibração foi realizada e as tensões dos sensores detectores durante a medição. Todos estes dados adicionais e rastreamento asseguram o mais alto nível de confiança dos dados.

Resolução do sensor

A resolução do sensor é testada para assegurar que o sensor não acrescenta erros significativos à medição. O teste é realizado calculando o aumento do desvio padrão (st dev) de 10 µm de partículas de látex de poliestireno (PSL), como definido na figura 7. A resolução do cálculo deve ser inferior a 10%.

O AccuSizer automatiza os cálculos de resolução do sensor e relata os resultados dos testes como mostrado na figura 8. Ter canais de tamanho 1024 melhora a capacidade de calcular com precisão a resolução do sensor. O PSL de 10 µm só precisa ser analisado uma vez. A mesma medida usada para determinar o ponto de calibração também é usada para calcular a resolução do sensor.

Precisão na contagem de partículas

A precisão da contagem do instrumento utilizado é testada usando um padrão de contagem de partículas disponível na USP e em outras fontes. Os padrões de contagem são partículas PSL com um tamanho médio de 15 µm. A tabela 7 lista o procedimento básico de teste para o teste padrão de contagem.

Tabela 7: Procedimento de teste de contagem USP.

Medir a amostra em branco a 10 e 15 µm três vezes

Medir o padrão de contagem em 10 e 15 µm três vezes

Descartar o primeiro resultado, a média do segundo e do terceiro

Calcular as contagens médias em 10 e 15 µm

Subtrair as contagens em branco das contagens padrão

Compare as contagens ajustadas em 10 µm com os valores esperados

Compare as contagens a 10 µm/contagens a 15 µm com os valores esperados

 

Os valores esperados são fornecidos no certificado de análise fornecido com o padrão de contagem. Um valor típico de um lote anterior forneceu estes resultados esperados:

. Conta em 10 µm: entre 3330 e 4110 contagens/mL;

. Razão de contagens em 10 µm para as contagens em 15 µm: entre 1,78 e 2,57.

Este teste particular tem causado a maior ansiedade para os usuários e engenheiros de serviço devido às despesas e ao volume limitado das garrafas padrão de contagem USP. O sistema AccuSizer SIS é ideal para realizar o teste padrão de contagem USP por diversas razões:

. Os testes, cálculos e relatórios são automatizados no software AccuSizer (figura 9);

. O ponto da curva de calibração de 15 µm pode ser otimizado e ajustado antes e depois da análise do padrão de contagem;

. Desta forma um único conjunto de medidas sempre produzirá resultados aceitáveis.

Uma característica única no software AccuSizer é a capacidade de reanalisar os dados usando uma curva de calibração atualizada. A maioria das falhas padrão de contagem USP vem do cálculo da relação. Um pequeno erro no ponto da curva de calibração de 15 µm pode criar uma grande mudança no cálculo da relação. Se o teste falhar no cálculo da relação, um padrão PSL de 15 µm é usado para verificar se o ponto de calibração é preciso ou requer ajuste. Uma vez feito este ajuste, os dados padrão de contagem originais podem ser recalculados usando a nova curva de calibração.

Ambiente de teste e teste em branco

Tanto USP <788> como <1788> discutem como realizar a medição em branco para assegurar que o teste seja realizado em condições (como um capô de fluxo laminar) limitando o material particulado adicional. As medidas básicas de teste e as especificações para o teste em branco são mostradas na tabela 8.

Tabela 8: Teste em branco e especificações.

Usar um recipiente limpo, representativo do que será usado para os outros testes

Encha o vaso com 50 mL de água filtrada, gire para misturar

Degasificar a amostra por sentado, banho ultra-sônico ou a vácuo

Medir cinco amostras de 5 mL cada

Critérios de aprovação/reprovação: Número total de partículas em 25 mL ≥10 µm deve ser inferior a 25 (1 partícula/mL em média)

Nota: Para USP <789> testar o número de partículas ≥25.

Automação

Os sistemas AccuSizer fornecem o mais alto nível de calibração, validação, medição e automação de relatórios, como já discutido neste documento. Além disso, toda a sequência de medição pode ser automatizada para análise de amostras de alto rendimento com o uso de duas soluções opcionais de amostrador automático.

O AccuSizer Autosampler (figura 10) pode ser usado para realizar testes USP <788> ou <789> em amostras múltiplas – até 24 para frascos de amostras de 30 mL. São possíveis maiores quantidades de amostra para volumes de amostra menores. Protocolos sofisticados para as funções de medição e amostrador automático podem imitar as medições manuais, mas fornecem automação completa após a bandeja de amostras ser carregada.

O analisador de microplacas AccuSizer A2000 MPA (figura 11) pode ser usado para testes USP <787> em volumes de amostra menores, de até 180 µL. Uma ou duas microplascas de 96 poços (volume do poço = 1 mL) são carregadas no sistema, os protocolos de medição e amostragem automática são definidos e então todas as análises são completamente automatizadas.

Conclusões

Os sistemas Entegris Accusizer e Nicomp são soluções únicas para testes de partículas subvisíveis em injeções, soluções oftálmicas e emulsões lipídicas. A combinação da mais alta tecnologia de especificação com opções avançadas de software e automação fazem destes os instrumentos mais avançados disponíveis para o teste de partículas USP.

Sobre a Entegris

A Entegris é líder em soluções de especialidades químicas e materiais avançados para a indústria de microeletrônica e outras indústrias de alta tecnologia. A Entegris é certificada ISO 90001.